2010届硕士研究生答辩公告
论文题目：小麦早衰鉴定指标及生理特性的研究
研究生姓名：陈朝儒
专业名称：作物遗传育种
研究生类别：硕士
指导教师：刘曙东 教授 作物遗传育种
答辩委员会主席：高翔教授
委员：奚亚军教授、赵惠贤教授、胡银岗教授、韩德俊副教授
答辩时间：2010年6月1日下午2：30
答辩地点：农学院二楼会议室
论文摘要：小麦是我国第二大粮食作物，播种面积占农作物总面积的27％左右，在我国粮食安全保障中起着重要的作用。小麦产量形成的最重要的时期是开花后籽粒灌浆期，而籽粒产量的形成主要来自小麦旗叶的光合同化产物，但是，小麦籽粒的灌浆时期正好伴随着功能叶片的衰老过程，因此，小麦早衰反映在一系列生理和形态变化上，并对籽粒产量有严重的影响。旗叶生理活性和功能变化对籽粒充实有重要影响，决定着籽粒干物质的生产与积累，并最终影响籽粒产量。小麦正常成熟的基本特征是生育后期功能叶片衰老与籽粒充实同步进行，如果功能叶片衰老进程早于籽粒充实或者衰老速度高于籽粒充实即表现为早衰。
在小麦育种实践中小麦早衰与早熟常常交织在一起，因此，如何正确区分早衰和早熟，建立一个科学的小麦早衰判别指标具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究以23个生育后期发育进程个不相同的黄淮麦区小麦品种（系）为材料，主要通过测定后期旗叶和颖壳持绿性、籽粒灌浆充实进程，建立小麦早衰鉴定指标；并研究不同衰老类型小麦发育后期的生理生化特性，以期为小麦早衰鉴定和抗早衰育种提供依据。其主要结果如下：
1、综合小麦开花后旗叶叶绿素含量的变化、旗叶与颖壳叶绿素含量比值变化、粒重及饱满度（干籽粒体积/最大理论体积），采用离差平方和法聚类分析，将23个品种（系）分为衰老程度不同的4类，即早衰型、轻度早衰型、正常成熟型和穗黄叶绿型。饱满度可作为小麦早衰的简单、快捷、可靠的鉴定指标；旗叶和颖壳叶绿素含量变化对比可作为小麦早衰的田间初步鉴定指标。
2、根据所建立的早衰的鉴定指标将23份材料分为4类：Ⅰ类，穗黄叶绿型，后期旗叶持绿时间长，麦穗适时落黄，包括阿勃、中育6号、郑农16号、秦麦187、安农91168、邯6172、周麦13-1等7个品种（系），籽粒饱满度高，饱满度达到63.94%以上；Ⅱ类，正常落黄型，包括小偃6号、温麦6号、86(77)、予同Me23等4个品种（系），该类型品种（系）后期旗叶转色与麦穗转色基本同步，籽粒饱满，饱满度达61.94%~62.42%，；Ⅲ类，轻度早衰型，包括皖33、鲁13、9125、20491-1等4个品种（系），籽粒充实稍滞后于叶片衰老，籽粒较为瘪瘦，饱满度在58.87%~60.12%；Ⅳ类，典型早衰型，包括925-6、98302、9411、38、9168、9125、924-1、98301、96309等8个品种（系），该类型品种（系）后期旗叶转色明显早于麦穗，籽粒瘪瘦，饱满度在53.67%~57.02%。
3、开花后不同类型品种（系）旗叶生理变化不同：穗黄叶绿型品种（系）旗叶超氧化物酶（SOD）、过氧化物酶(POD)活性高且下降缓慢，MDA水平低且上升缓慢，净光和速率高且下降缓慢；正常落黄成熟型品种（系）旗叶SOD、POD活性高且下降比较缓慢，MDA水平较低且上升比较缓慢，净光和速率高且下降较缓慢；轻度早衰型品种（系）旗叶超氧化物酶（SOD）、过氧化物酶(POD)活性相对较高且下降较快，MDA水平较低且上升较快，净光和速率较高且下降较慢；典型早衰型品种（系）旗叶超氧化物酶（SOD）、过氧化物酶(POD)活性相对较高且下降快，MDA水平较低且上升快，净光和速率较高且下降快。
研究生姓名：王永鹏
论文题目：波兰小麦对普通小麦部分品质性状的改良作用研究
专业名称：作物遗传育种
研究生类别：硕士
指导教师：刘曙东 教授 作物遗传育种
答辩委员会主席：高翔教授
委员：奚亚军教授、赵惠贤教授、胡银岗教授、韩德俊副教授
答辩时间：2010年6月1日下午2：30
答辩地点：农学院二楼会议室
论文摘要：波兰小麦(Triticum polonicumL.,2n=4x=28=AABB)属四倍体小麦裸粒栽培种，具有穗大、粒重、品质好等许多优良农艺性状，特别是蛋白质含量高达18％以上，是选育高产、优质小麦新品种的重要遗传资源。本文先对波兰小麦×中13杂交后代110个株系进行了细胞染色体数的观察，并研究染色体数变异对部分性状的影响；再采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS一PAGE)技术对波兰小麦×中13杂交后代110个株系的高分子麦谷蛋白亚基(High Molecular Weight Gluentin Subunits，HWM一GS)进行了检测；最后测定分析了波兰小麦×中13杂交后代41个株系的蛋白质含量、沉降值及面筋含量。探讨波兰小麦应用于普通小麦育种的可能性，为合理利用这些遗传资源，改良普通小麦提供理论依据和物质基础。其结果表明如下
1发现了波兰小麦×中13杂交后代110个株系染色体中有7个株系染色体变异，其中3个株系染色体42条或少于42条，4个株系染色体少于42条，占6.36%，其余正常，并研究表明染色体变异对小麦分蘖数、始花期有显著影响。
2亲本波兰小麦含有7＋9高分子量麦谷蛋白亚基，中13含有7＋9，2＋12高分子量麦谷蛋白亚基。波兰小麦×中13的杂交后代株系中，106个株系含有7＋9亚基，其传递率为96.36%；109个株系含有2＋12亚基，其传递率为99.09%。，104个株系同时含有7＋9，2＋12亚基，其传递率为94.54%。杂交后代株系麦谷蛋白共产生了3种新亚基，分别是7、7＋8和14+15亚基，其频率分别为1.82％、1.82％和0.91％；产生了4种新的亚基组合，分别是7，2＋12、7+8，2＋12、 7+9、7+9，14+15和2＋12，其频率分别为1.82％、1.82％、0.91％和0.91％。亚基变异主要出现在BC1F7株系中，显然，随着杂种与普通小麦亲本中13的回交代数增加，新亚基和新的亚基组合出现的概率减少。
3杂交后代株系平均蛋白质含量、沉降值、干面筋含量和湿面筋含量都显著高于普通小麦亲本中13。杂交后代株系的蛋白质含量平均值与优质对照品种小偃6号间没有显著差异，而且有5个株系高于对照，但杂交后代株系的平均沉降值和平均湿面筋含量没有达到优质对照品种小偃6号的水平。虽然波兰小麦的沉降值偏低，但与普通小麦杂交的后代往往表现出超亲遗传，BC1自交后代株系的平均蛋白质含量和干面筋、湿面筋含量与BC2自交后代株系没有显著性差异。说明了回交一代与回交两代对蛋白质含量、面筋含量影响不大。但 BC1自交后代株系比BC2自交后代株系的变异更加丰富。
研究生姓名：王贵
论文题目：早衰小麦近等基因系旗叶功能期的生理特性研究
专业名称：作物遗传育种
研究生类别：硕士
指导教师：刘曙东 教授 作物遗传育种
答辩委员会主席：高翔教授
委员：奚亚军教授、赵惠贤教授、胡银岗教授、韩德俊副教授
答辩时间：2010年6月1日下午2：30
答辩地点：农学院二楼会议室
论文摘要：小麦是我国的重要粮食作物，是人类的主食之一。我国人口多，耕地少，提高小麦产量成为解决粮食危机的重要途径。小麦籽粒产量主要来源于小麦生育后期冠层叶片尤其是旗叶的光合作用。因此，适当延长小麦旗叶光合功能期是提高小麦光合效率和产量的重要途径之一。早衰小麦显著缩短了小麦叶片光合功能期，造成很大程度的减产。研究早衰小麦的生理和遗传基础，对于理解小麦早衰成因和延长小麦旗叶功能期具有重要的理论和实践意义。
本实验以小偃54×8602的F8分离品系中的早衰和正常小麦近等基因系为试验材料。在旗叶完全展开后，分别测定了叶绿素含量、丙二醛含量、超氧阴离子含量、清除自由基的酶促和非酶促系统，以及碳氮循环中的蔗糖、葡萄糖、可溶性总糖的含量，测定了叶片中硝酸还原酶、蔗糖磷酸酶、蔗糖合酶等酶活性。以及小麦光合速率、叶面积、茎干重、穗干重、产量的变化，旨在揭示小麦籽粒灌浆期衰老的规律，探索植株衰老评价的指标体系，为小麦高产抗逆栽培提供理论依据。
抗氧化物质花青素是近年来研究的热点，是植物体内最强的活性氧自由基清除剂之一。我们以京411为试材，小偃54为对照研究了经强光诱导后花青素在小麦叶片中的含量、分布、种类以及QTL定位。
研究得出如下主要结果：
1、小麦叶片衰老表现为叶绿素及可溶性蛋白质降解，而且伴随着活性氧代谢的失调；活性氧积累启动膜脂的过氧化作用，导致膜的损伤和破坏，引起膜脂过氧化产物丙二醛的增加。
2、早衰小麦旗叶中抗氧化物质含量与活性较对照品种没有显著的差异，清除活性氧的关键酶除POD外，其他如 SOD、CAT、APx等酶活性显著低于对照品系。
3、碳氮循环系统的稳定是植物体维持库－源流正常的保证。本实验中早衰小麦碳氮代谢与对照品系有极显著的差异，其碳氮代谢的失衡可能是造成其早衰的主要原因。
4、在强光诱导花青素的研究中，结果表明其花青素种类可能是天竺葵色素。老叶首先积累花青素，其含量随叶片自下而上依次降低。同一叶片自叶尖部至叶基部花青素含量依次降低。我们将控制花青素性状的位点定位在7A染色体上。
研究生姓名：白娜
论文题目：哈茨木霉WRF-2木质素降解酶系的优化及其对玉米秸秆生物降解研究
专业名称：作物遗传育种
研究生类别：硕士
指导教师：奚亚军 教授 作物遗传育种
答辩委员会主席：高翔教授
委员：刘曙东教授、赵惠贤教授、胡银岗教授、韩德俊副教授
答辩时间：2010年6月1日下午2：30
答辩地点：农学院二楼会议室
论文摘要：农作物秸秆是自然界中广泛存在的可再生生物质资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。木质素结构高度复杂难于被降解，使秸秆生物质的利用受到很大限制。传统的物理化学处理方法能耗高、污染大，如何利用现代生物技术方法实现木质素的高效分解与低耗无害转化已成为新的研究课题。本文以自主培育的可降解木质素的哈茨木霉WRF-2菌株为实验材料，进行了以下几个方面的研究：（1）优化了哈茨木霉WRF-2菌株生产木质素过氧化物酶的培养条件；（2）通过紫外诱变的方法获得锰过氧化物酶活力较高的优良突变菌株，分析锰过氧化物酶的酶学性质及纯化出锰过氧化物酶并测定其分子量大小；（3）通过添加乙酰丙酮、H2O2和MnSO4?H2O，初步研究诱变菌株粗酶液对玉米秸秆木质素降解作用效果，取得以下实验结果：
1、采用浅层振荡发酵方式，通过单因素试验和正交试验对木质素过氧化物酶的生产条件进行了优化。结果表明，低碳高氮浅层振荡培养有利于哈茨木霉产胞外木质素过氧化物酶（LiP）的分泌。其最佳发酵条件为30℃、200 rpm/min摇床培养3 d。培养基成分最佳组合为淀粉0.60 g?L-1，酵母粉7.50 g?L-1，KH2PO4 4.0 g?L-1，MgSO4 0.5 g?L-1，CaCl2?2H2O 0.05 g?L-1，藜芦醇2.0 mmol?L-1，微量元素溶液 40 mL?L-1，吐温80 2.0 g?L-1，pH 4.5。经优化培养，LiP的活性从996.72 U?L-1提高到2162.4 U?L-1，酶活高峰时间从培养9天缩短到3天，极大的提高了酶的活性和缩短了酶高峰的培养周期。
2、通过紫外线照射出发菌株WRF-2孢子悬液，选育获得一株生长较快，产酶能力较强的突变菌株（定名为0202），其木质素过氧化物酶（LiP）活力提高了17.98%，锰过氧化物酶（MnP）活力提高了169.57%。经过酶学性质分析，0202菌株粗酶液中MnP作用的最适温度为40℃，最适pH为3.0，在pH 2.5~3.5以及温度50℃以下酶活力稳定。Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+对0202菌株的MnP活性起促进作用，Fe2+、Zn2+对MnP则有抑制作用。对粗酶液进行盐析和DEAE-52柱纯化，获得具有MnP活性的组分，通过SDS蛋白电泳初步测得了锰过氧化物酶分子量约为45KDa。
3、利用诱变菌株粗酶液降解玉米秸秆木质素并对降解条件进行优化，结果表明在40℃、pH3.0条件下，将40 mL粗酶液（诱变菌株0202）加入到1 g玉米秸秆粉中，酶解48 h，其中体系中加入0.1 mmol?L-1的H2O2、5 mM的MnSO4?H2O、50 mM乙酰丙酮，玉米秸秆木质素的降解率为25.61%，半纤维素损失2.22%，纤维素损失1.17%。说明采用LiP-MnP木质素降解酶系对玉米秸秆木质素有降解作用，其中MnP的活性提高有利于秸秆中木质素的降解。
研究生姓名：宋立立
论文题目：淀粉糖化关键酶基因的克隆与表达
专业名称：作物遗传育种
研究生类别：硕士
指导教师：奚亚军 教授 作物遗传育种
答辩委员会主席：高翔教授
委员：刘曙东教授、赵惠贤教授、胡银岗教授、韩德俊副教授
答辩时间：2010年6月1日下午2：30
答辩地点：农学院二楼会议室
论文摘要：利用淀粉生产乙醇过程中，因为缺乏水解淀粉酶类，不能直接利用淀粉作为原料。因此，人们一直设想利用基因工程的手段获得可以直接分解和利用淀粉的酵母工程菌或者大肠杆菌，从而省去淀粉经蒸煮、淀粉酶液化、酸解或糖化酶处理等步骤，进而简化工艺、缩短时间、节省能源，降低成本，实现高效工业化生产。其中如何找到能高效水解淀粉的淀粉糖化酶等基因，使其两种或者三种酶共同作用，利用基因工程的手段将降解淀粉的酶类基因导入酵母菌中或者大肠杆菌，最后得到高效、稳定的表达一直是人们研究的重点。
本文主要研究了和淀粉糖化有关的淀粉糖化酶基因、果胶裂解酶基因和木聚糖酶基因的克隆及在大肠杆菌或者在巴斯德毕赤酵母菌株中的表达，经诱导测定其生物学活性。取得的主要结果如下：
1、根据已经公布的米根霉菌种中淀粉糖化酶基因同源序列设计引物，利用米根霉的基因组DNA为模板，克隆得到淀粉糖化酶编码基因glu。将其克隆到表达载体pPIC9K上，转化毕赤酵母，重组菌株在甲醇的诱导下96h酶活力最高达到71.66U/mL；经SDS-PAGE分析，在甲醇的诱导下96h蛋白表达量最大，其大小约为65KDa。
2、从枯草芽孢杆菌和海栖热袍杆菌中克隆得到3个果胶裂解酶基因，将3个基因克隆到表达载体pPAL7上，转化大肠杆菌BL21，重组菌株经IPTG诱导，三个基因在温度50℃，pH8.0，添加终浓度为5.5mmo/L的Ca2+的条件下，诱导6h酶活力最高，分别为30U/ml、6.52U/ml和36.86 U/ml；经SDS-PAGE分析，分别在45KDa、18 KDa和40 KDa处呈现表达蛋白条带。
3、采用RT-PCR方法从实验室筛选到的桔青霉CR-2菌株中克隆得到木聚糖酶的cDNA序列，将木聚糖酶的基因分别构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K和原核表达载体PPAL7上,转化酵母菌GS115和大肠杆菌BL21。重组子经PCR鉴定后分别用1 %的甲醇和0.08mmol的IPTG进行诱导。对重组木聚糖酶活检测显示该基因在毕赤酵母中表达时，酶活在诱导培养96 h达23.84IU/ml；在原核表达系统中，在诱导6h酶活性最高达到2.07 IU/ml。
4、将来源于海栖热袍杆菌的果胶裂解酶基因和来源于桔青霉CR-2的木聚糖酶基因构建融合基因，设计引物将其克隆到pPAL7上，转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，重组菌株在IPTG的诱导下6h酶活力最高分别达到30.11U/ml和2.03IU/ml。
研究生姓名：杨进军
论文题目：PSAG12-IPT基因转化黄淮麦区骨干品种及农杆菌
对小麦结实和种子萌发的影响
专业名称：作物遗传育种
研究生类别：硕士
指导教师：奚亚军 教授 作物遗传育种
答辩委员会主席：高翔教授
委员：刘曙东教授、赵惠贤教授、胡银岗教授、韩德俊副教授
答辩时间：2010年6月1日下午2：30
答辩地点：农学院二楼会议室
论文摘要：黄淮麦区是我国小麦的主产区，其产量高低对我国粮食安全问题起着举足轻重的作用。优良品种是提高小麦产量最经济有效的措施，而叶片早衰是影响黄淮麦区小麦产量提高的限制因素之一。延缓后期叶片衰老，提高光合效率，可显著提高小麦的籽粒产量。IPT基因能合成和积累细胞分裂素，起到延缓植物衰老的作用。本试验利用花粉管通道法和基因枪法将叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT转化黄淮麦区小麦几个主要骨干品种，以期获得叶片衰老进程得到延缓的转基因小麦，为育种创造新种质。同时，对农杆菌浸花后小麦结实和种子萌发的影响进行了研究，为探索建立小麦乃至其他植物农杆菌浸花法遗传转化体系和提高转化效率提供一定参考。取得的主要研究结果包括：
1、以西农979、西农889和郑麦9023为受体，采用300ng/μl质粒DNA，利用花粉管通道法进行转化。经PCR分析，西农979 和西农889分别获得2株和5株导入了叶片衰老抑制基因PSAG12?IPT的转基因小麦，初步证明带有特异启动子的PSAG12-IPT基因已整合到小麦基因组中，通过衰老进程及农艺性状分析，证明PSAG12?IPT在4株转基因小麦的衰老叶片中特异性表达,其中1株为西农979，3株为西农889，叶片衰老性状得到了明显改善。其中以西农889小麦转化效率较高，郑麦9023未获得转基因植株。
2、试验采用裂区设计，以小麦品种包括郑9023、西农889和西农979为主区，农杆菌菌液浓度设置为0，0.5、1.0和1.5OD四个处理为副区，研究了农杆菌浸花处理对小麦结实及后代种子萌发的影响。结果表明，品种和农杆菌菌液浓度对小麦结实率、千粒重、种子发芽率、幼苗高度、幼苗鲜重、幼苗干重、幼苗根长、叶绿素含量、MDA含量、POD、SOD活性及卡那霉素抗性苗率影响的互作效应不显著；随着农杆菌菌液浓度的增加，小麦不同品种的结实率、种子发芽率、幼苗高度、幼苗鲜重、幼苗干重、幼苗根长、叶绿素含量、POD及SOD呈降低趋势； MDA含量和卡那霉素抗性苗率总体随着着农杆菌菌液浓度的增加而增加；小麦不同品种对农杆菌的反应存在一定基因型差异。综合农杆菌对小麦结实和种子萌发的影响及卡那霉素抗性苗率，农杆菌浸花处理的使用浓度在1.0?1.5OD范围可能较为适宜。
3、利用基因枪介导法，以西农1376和小偃22幼胚预培养3天的愈伤组织为受体，经过抗性筛选并获得了再生植株。
