西北农林科技大学博士研究生学位论文预答辩
院（系、部）名称：农学院 学科专业：作物遗传育种
研究生姓名：孟敏 导师姓名：高翔 入学时间：2010年9月
预答辩时间：2013年6月20日 地 点：科研楼2208室
一、学位论文题目：黄淮麦区小麦骨干品种（系）淀粉品质测定及Waxy蛋白亚基组成的毛细管电泳鉴定
二、学位论文预答辩委员会组成
组成
姓名
职称
博/硕导
所在单位及学科专业
主席
张改生
教授
博导
农学院，种子工程
成员
奚亚军
教授
博导
农学院，作物遗传育种
王晓峰
教授
博导
园艺学院，植物生化和分子生物学等
王中华
教授
博导
农学院，作物抗旱与表皮蜡质的分子合成机理等
王保通
教授
博导
植保学院，
秘书
陈其皎
博士
硕导
三、论文摘要
黄淮麦区是我国小麦重要产区，包括山东全部省区，河南省除信阳以外的大部地区，河北省中南部地区，安徽及江苏两省的淮北地区，陕西省的关中平原地区，甘肃省的天水地区以及山西省西南地区。全区小麦总产量及种植面积分别占全国小麦面积和总产量的60％及45％左右。
淀粉是禾谷类作物籽粒中一类重要的多糖聚合物，其质与量影响到作物产量及加工品质。在小麦籽粒中，由直、支链淀粉共同构成的淀粉约占干物质总量的75-80%。其中，控制直链淀粉合成的关键酶为颗粒结合型淀粉合成酶（granule-bound starch synthase I, GBSSI,又称Waxy蛋白)，该酶活性的高低会改变籽粒中直链淀粉的含量，并最终影响到面条加的工品质；另外，作物籽粒的蛋白分析表明，该酶本身在收获的籽粒中也具有一定的含量；序列分析表明，Waxy蛋白具有极为丰富的奇数个半胱氨酸含量，存在着与高分子量谷蛋白类似的分子间二硫键。迄今，有关该酶分离及快速鉴定方式、酶活性的决定位点、在栽培小麦品种中各亚基类型的最终积累量及与调控因子的关系以及黄淮麦区品种（系）Waxy的多样性分布以及小麦籽粒中Waxy蛋白是否对面粉加工品质造成影响等问题尚未系统展开。
本研究首先从公认的Waxy蛋白三亚基都存在的中国春小麦为标准品构建了高效毛细管电泳体系，然后以与小麦亲缘关系很近的二倍体黑麦为标品，通过品质参数的测定关联性分析、毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)、DuoFlow纯化、分子标记、SDS-PAGE、编码序列分析等方法；实现Waxy蛋白的高效分离、亚基类型的最终积累量的确定；明确了黄淮麦区品种（系）Waxy的多样性分布以及籽粒中Waxy蛋白对面粉加工品质造成影响；同时获得了Waxy蛋白行使酶促功能的关键位点和Waxy基因5’-UTR调控特点。具体研究结果如下：
1. 以二倍体黑麦为模式，构建了Waxy蛋白的纯化及CE快速鉴定体系：以奥地利黑麦籽粒为材料，通过优化挂柱及洗脱缓冲液成分、洗脱梯度与体积、检测波段等，构建了能特异分离黑麦籽粒Waxy蛋白的DuoFlow制备级纯化体系；同时，综合籽粒Waxy蛋白SDS-PAGE、原核表达、基因序列推导、蛋白质的MALDI-TOF鉴定法，确定了DuoFlow分离蛋白的Waxy属性。另外，通过对缓冲液各成分浓度的优化，建立了黑麦籽粒Waxy蛋白的毛细管快速鉴定体系。
2. 构建了针对普通小麦Waxy蛋白亚基的纯化及毛细管鉴定体系：在传统单籽粒提取Waxy蛋白的基础上采用丙酮沉淀法，获得高纯度蛋白，在黑麦CE分离体系的基础上，实现了对Waxy蛋白的高效、快速的分离。该方法简单，快速，具有很好的应用前景，能快速分离Waxy亚基，并能实现对每种类型的初步定量，并建立一种快速有效的方法来定量分析籽粒中Waxy蛋白的残留量。该体系对黄淮冬麦区292份小麦品种/系的鉴定，在6-10 min处均出现峰最高约50mAU的三个峰，图形清晰，基线水平。292个品种初步确定为5种类型的亚基构成。
3.对黄淮麦区骨干品种（系）Waxy类型进行了统计：通过测定和分析292份黄淮麦区普通小麦品种的直链淀粉合成、支链淀粉含量、Waxy蛋白酶活性、RVA等参数，筛选出16份骨干品种，作为进一步研究的试材。
4. 5’-UTR序列对籽粒Waxy蛋白最终积累量的影响：在分析包括中国春小麦在内16个品种的小麦Waxy基因5’-UTR调控区序列，结果表明在不同的品种中来源同一染色体的序列中，TATA-box，CAAT-box，GC-box，G-box的分布具有一定的保守性特征。未发现其他关键调控原件，由此推测，Waxy基因的5’-UTR并不影响GBSSI蛋白的表达水平。
5.淀粉含量对糊化参数的影响：利用黑麦做模式作物进行关联性分析。多因素关联分析结果表明，黑麦面粉的淀粉糊化参数（峰值黏度、低谷黏度、最终黏度、稀懈值、反弹值）之间存在显著或者极显著相关性。
6. Waxy酶活性位点的确认：Waxy蛋白酶活性与直链淀粉含量、支/直淀粉含量比也呈显著或者极显著（负）相关，但尚未发现糊化参数与Waxy酶活与直链淀粉含量（比）之间的相关性；而关联系分析表明，260号氨基酸同时影响到RVA淀粉糊化参数及Waxy蛋白酶活性，从而在分子水平实现表型上无法统一的性状关联；研究同时在酶催化域发现141aa、152aa位点的功能性位点；位于柔韧区的363aa同样影响着Waxy酶活性。
7. Waxy蛋白对面粉加工品质的效应：用IPTG诱导的Waxy蛋白高效原核表达。MALDI质谱鉴定证明我们成功表达的三个Waxy蛋白亚基；通过His-Trap亲和层析纯化的表达蛋白在微量掺粉试验中表明表达产物延长稳定时间，降低了软化程度，提高面团的粉质质量指数（FQN）。微量掺粉试验中表明Waxy蛋白对小麦品质的优化承担一定的重任，为小麦品质改良及分子育种提供了参考。
关键词：黄淮冬麦区；黑麦；毛细管电泳；Waxy蛋白资源；Duoflow蛋白纯化系统；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
