| 课程编号:0130000042 一、 实验要求 要求学生通过本课程实验教学,加深理解和巩固所学理论知识,掌握一些生物技术基本实验技能,学会设计试验,正确使用常规仪器,正确记录,合理分析、讨论实验结果。同时加强对学生进行科学素质和良好的实验室工作习惯的训练。 二、实验教学条件 农学院分子生物学实验室已具备分子生物学试验的基本条件,可满足“细菌质粒提取”实验的顺利完成;农学院细胞工程实验室具备细胞培养的基本条件,可满足“植物转基因”综合设计实验的完成。 三、实验材料 植物:油菜、烟草等。 微生物:大肠杆菌和农杆菌。 四、实验课主要内容
序号 |
实验项目 |
学时 |
实验类别(基础实验、综合实验、设计实验等) |
实验类型(上机、实验等) |
实验内容 |
具体要求 |
1 |
细菌质粒提取 |
2 |
基础实验 |
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2 |
农杆菌介导的植物遗传转化 |
8 |
综合设计实验 |
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农杆菌培养;
植物外植体培养;
农杆菌转化植物;
转化体筛选 |
实验设计完整可行;能熟练掌握无菌操作技术。 |
3 |
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4 |
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| 五、考核方式与评分办法 1. 实验设计方案 30%; 2. 试验操作和技能 40%; 3. 试验结果与分析 30%。 实验一 质粒DNA的提取 (基础实验) 实验目的 使学生了解细菌质粒提取的不同方法,掌握细菌培养的方法和大肠杆菌质粒微量提取的方法。 实验原理 碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线状的DNA双螺旋结构解开变性,共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂,但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性,而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,而质粒DNA却留在上清液中。 仪器、材料与试剂 仪器:恒温培养箱、恒温摇床、小型高速离心机、高压灭菌锅。 材料:带有质粒的大肠杆菌 试剂: Solution I 50mmo1/L 葡萄糖 5mmo1/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0) 1.0 mmo1/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) Solution II 0.4mo1/L Na0H,2%SDS(十二烷基硫酸钠),用前等体积混合 Solution III 5mo1/L 醋酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL TE缓冲液 10mmo1/L Tris·HCl 1mmo1/L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶(RNA酶A) 将RNA酶溶于10mmo1/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1/L NaCl中,配成10 mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。 实验步骤 (采用SDS碱裂解法小量制备质粒DNA) 1.大肠杆菌培养 2.提取质粒 3.质粒的琼脂糖凝胶电泳 实验操作步骤 1.将过夜培养的2m1细菌,高速离心1分钟,彻底去除上清。 2.加入100ml solution I,用枪头或振荡器充分悬浮细菌。 3.加入200ml Solution II,立即上下颠倒或用手指弹管底,使细菌裂解,室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。 4.加入400ml Solution III,立即上下颠倒5~10次,使之充分中和,室温放置2分钟。 注意:步骤2和3在冰上操作效果更佳。 5.高速离心,15,000转/分钟,10分钟。无需低温离心。 注意:提高离心速度,使沉淀更加紧密,步骤6操作取上清更为方便。 6.取出2m1样品收集管和3S柱,在管壁标上样品号,将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子,室温放置2分钟 (室温放置时间不重要,可长可短);用台式离心机室温高速(12,000转/分钟)离心1分钟。 注意:转移上清时不要吸取沉淀,否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。 离心管盖子盖上时,柱子内压的增加,可能会使部分溶液从柱子底部流出,为正常现象。 7.取下3S柱,弃去掉收集管中的废液,将3S柱放入同一支收集管中,吸取700ml Wash Solution到3S柱,离心1分钟。 8.重复步骤7一次。 9.取下3S柱,弃去掉收集管中的废液,将3S柱放入同—支收集管中,高速离心2分钟。 10.将3S柱放入干净的1.5m1的离心管中,在3S柱子膜中央加 50ml TE或水,不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟;盖上离心管盖,室温高速离心1分钟。 注意:将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱,浓度一般满足测序要求。 11.洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞,质粒如果用50ml水洗脱,通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。
实验二 农杆菌介导的植物遗传转化 (综合设计实验) (一)实验目的 1.使学生全面了解农杆菌介导的植物转基因的方法; 2.使学生根据已学的知识,在教师指导下设计一个农杆菌介导植物的遗传转化实验方案; 3.使学生掌握农杆菌培养,植物外植体无菌系建立,农杆菌侵染和转化体筛选等一系列试验方法。 (二)培养基 1.LB培养基:每升含有:酵母浸膏 5 g , 胰蛋白胨 10 g ,NaCl 5 g ,PH 7.2 2.YEB培养基:每升含有:牛肉浸膏 5 g ,酵母浸膏 1 g ,蛋白胨 5 g ,蔗糖 5 g ,MgSO4·H2O 0.5 g ,PH 7.0 3.YEP培养基:每升含有:牛肉浸膏 10 g ,酵母提取液 10 g ,NaCl 5 g ,PH 7.0 4.实生苗培养基: 1/2MS培养基,附加30g蔗糖和0.6%琼脂,PH=6.0。 5.预培养基:MS+1.0~1.2mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+30g蔗糖+6g琼脂,PH=5.8。 6.分化培养基:MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+30g蔗糖+6.5g琼脂+AgNO36mg/L, PH=5.8。 7.筛选培养基:分化培养基+AgNO3 6mg/L+500mg/L Cb+10mg/L Kan,PH=5.8。 (三)试验仪器 超级超净工作台 智能气候培养箱 大型落地式高速冷冻离心机 凝胶成像系统 台式常温高速离心机 立式灭菌锅 电泳相关设备 (四)农杆菌介导植物转化实验步骤(以油菜子叶转化为例) 1.根癌农杆菌的培养 将保存于甘油中的菌种用划线法接种于LB固体平板培养基上培养,每次转化前一天从平板上挑取单菌落接种于YEB液体培养基中,在26℃,170r/min的摇床上过夜培养,当OD600值达0.3~0.5时,将其在4000r/min的条件下离心5min,弃去上清,然后用液体MS培养基将其重悬稀释5~8倍待用。 2.建立无菌苗 将油菜种子用75%酒精浸泡30s后,于0.1%HgCl2溶液中处理10min,无菌水冲洗3次后,接种于1/2MS固体培养基上,在25±1℃黑暗条件下培养3d,后移至光下培养1~3d,取其下胚轴和带柄子叶接种在预培养基上,在25℃,光照强度为2000lux,16h光照周期培养条件下培养,待用。 3.农杆菌侵染 在无菌条件下,将预培养2d子叶和下胚轴收集于一个无菌小烧杯中,浸入于活化并稀释了5~8倍的农杆菌液中,5min后转到无菌滤纸上,吸干多余的菌液,接至共培养培养基中,在25℃生化培养箱中共培养2 d。 4.分化培养 将共培养2d的受体材料先用无菌水冲洗2~3次至水澄清后,用500mg/LCef浸泡30~40min,材料取出并置于含有无菌滤纸的培养皿中干燥2d。将培养物转移至附加8~15mg/L卡那霉素和500mg羧苄青霉素(或头孢霉素)的分化培养基中,在25℃,昼夜光周期为16/8h恒定光照条件下培养, 5.筛选培养 将分化培养中获得的绿芽移置筛选培养基(卡那霉素浓度升致25mg/L),每隔15~20d转接一次。 注:上述方法步骤供学生设计实验方案时参考。学生可自己设计烟草的遗传转化实验方案。
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